Jak w większości gier z Mario, fabuła SMB3 jest znikoma i służy raczej jako tło do rozgrywki. Mario i Luigi wyruszają na pomoc siedmiu królom panującym nad siedmioma sąsiadującymi światami składającymi się na Mushroom World. Każdemu z nich została skradziona magiczna różdżka i zostali zmienieni w zwierzęta przez Koopalings. Zadaniem braci Mario jest odzyskać różdżki i zmienić króli z powrotem w ludzi. Na końcu siódmego świata okazuje się, że atak na Mushroom World został przeprowadzony po to, by odsunąć braci Mario od Księżniczki Peach, umożliwiając Bowserowi porwanie jej. W ostatnim, ósmym świecie gracz ma za zadanie uratować księżniczkę.